Учёные Крымского федерального университета им. В. И. Вернадского разрабатывают антисмысловые генные технологии для лечения ревматоидного артрита. О проекте на данную тему рассказывает ведущий научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории Медицинского института им. С. И. Георгиевского Татьяна Макалиш.
Исследование проводится при поддержке Российского научного фонда.
В чём суть проекта?
— Олигонуклеотиды – это короткие участки ДНК, которые комплементарно могут связывать с участками ДНК макроорганизма и блокировать какие-либо процессы в нем. Они могут блокировать считывание гена (транскрипцию), синтез белка. В большинстве случаев в биологических исследованиях антисмысловые олигонуклеотиды нацелены именно на блокирование матричной РНК. Если мы прерываем синтез белка, то в клетке нарушаются внутренние процессы, и мы можем воздействовать на ее жизнедеятельность. Для работы с ревматоидным артритом мы использовали антисмысловые олигонуклеотиды, которые блокируют провоспалительные цитокины – фактор некроза опухоли и Интерлейкин-6, которые являются пусковыми факторами для развития заболевания.
Антисмысловые олигонуклеотиды начали изучать ещё, наверное, в 60-70-х годах прошлого века. Очень активно они изучались к концу тысячелетия и продолжают исследоваться до сих пор. Есть несколько вариантов олигонуклеотидов, которые модифицируются тем или иным образом, для того чтобы быть устойчивыми в клетке, поскольку для макроорганизма это всё же чужеродные фрагменты ДНК. И одна из проблем антисмысловых олигонуклеотидов заключается в том, что они мало устойчивы, потому учёные различными химическими трансформациями добиваются того, чтобы олигонуклеотиды жили в макроорганизме дольше. Мы занимаемся тиофосфатными олигонуклеотидами, у которых есть специальная модификация, продлевающая жизнь олигонуклеотида в клетке.
Первые исследования проводились в 2019 году под руководством Владимира Владимировича Оберемка. Тогда мы использовали олигонуклеотиды как цитостатики, останавливающие деление клеток при ревматоидном артрите у крыс. Затем мы получили внутренний грант по Программе развития университета, в котором занимались изучением антисмысловых олигонуклеотидов против фактора некроза опухоли. Тогда мы уже начали использовать олигонуклеотиды против цитокинов, которые являются пусковым механизмом для ревматоидного артрита. У нас получились неплохие результаты, действительно был достигнут положительный эффект. Но это не удовлетворило моё любопытство, мы продолжили искать дальше, и нашли ещё одну точку приложения – Интерлейкин-6.
Текущее наше исследование охватывает оба цитокина. Кроме внутриподкожного и внутримышечного введения, мы пробуем вводить олигонуклеотиды путём электрофореза, чтобы меньше травмировать орган. Мы также нацелены на исследование механизмов изменения костной ткани, поскольку при ревматоидном артрите, помимо синовиальной оболочки суставов, страдает в достаточной степени ещё и костная ткань, и оба исследуемых цитокина влияют на эти процессы.
Какие работы уже сделаны? Что ещё планируется сделать?
— За первый год реализации проекта мы смоделировали ревматоидный артрит у крыс. Для этого мы вводили им в хвосты полный адъювант Фрейнда – это, по сути, кишечная палочка в масляной взвеси, которая вызывает сильный воспалительный ответ в месте введения. Чаще всего этот препарат используют как адъювант в вакцинах, чтобы стимулировать иммунитет отвечать на введённый агент, а мы вызывали с его помощью сильное местное воспаление. Затем мы провели довольно долгий эксперимент: в течение месяца моделировали болезнь, ещё три месяца лечили животных. Болезнь мы моделировали на хвостах – это тоже отличительная особенность нашего исследования, поскольку нам удалось получить необходимый материал для исследования, сохранив при этом жизни животных.
У нас было несколько групп животных. Одних мы лечили инъекциями олигонуклеотидов, других – инъекциями стандартного препарата. Кроме того, была ещё контрольная группа, которую никак не лечили, а также контрольная группа, которой вводили инъекции с водой и электрофорезом, чтобы учесть дополнительный фактор повреждения в момент введения лекарства. Кроме того, мы забирали кровь у животных на разных сроках эксперимента, для того чтобы следить за уровнем цитокинов и количеством лимфоцитов различных кластеров дифференцировки, которые показывают, насколько сильным воспаление было на системном уровне. Нашей задачей было сравнение системного препарата и нашего препарата местного применения.
За первый год работы мы завершили всю экспериментальную часть, сейчас работаем над аналитической. На гистологическом материале можно увидеть, какие морфологические изменения произошли в ткани, насколько сильным было воспаление, как сильно повредились хрящевая и костная ткани. Иммуногистохимическими методами мы будем смотреть экспрессию металлопротеиназ – цитокинов, которые активно участвуют в перестройке внеклеточного матрикса, в том числе, и в костной ткани. Мы хотим исследовать первую, третью и девятую металлопротеиназы – это разные классы протеиназ, которые разрушают разные типы коллагенов. Наша задача – посмотреть, какой из них более активный, при блокировании какого олигонуклеотида он останавливается. Также с помощью иммуногистохимии мы выясним, какие типы лимфоцитов преобладали в воспалительном инфильтрате при различных схемах лечения. Методом ИФА будет исследоваться концентрация металлопротеиназ и цитокинов в периферической крови у крыс, а методом проточной цитофлюориметрии – количество различных видов лимфоцитов, но уже не в ткани, а в периферической крови, то есть во всём организме в целом, поскольку нам важно сравнить, какие изменения произошли в самой ткани в месте повреждения, и как это отразилось на состоянии организма в целом.
Какие результаты Вы планируете получить?
— Во-первых, это – фундаментальное исследование, которое преследует своей целью понять, какие изменения происходят в клетках костной ткани, в клетках синовиальной оболочки суставов, насколько важную и активную роль в этом играют Интерлейкин-6 и фактор некроза опухоли. Конечно, в идеальной перспективе результатом станет получение дополнительного лекарства, препарата поддерживающей терапии. Это вполне возможно.
Насколько это востребовано?
— Основной плюс антисмысловых олигонуклеотидов – это относительная дешевизна их получения. Такой препарат будет примерно в 5–10 раз дешевле препарата на основе антител, который сейчас применяется против провоспалительных цитокинов. Это позволит снизить нагрузку на систему здравоохранения, поскольку в основном такие препараты закупаются государством за бюджетные деньги.
Второй важный момент – это местное введение, благодаря чему пациент не страдает от побочных эффектов, вызванных системным введением. Основная проблема стандартной генно-биологической терапии – это антитела, которые являются белками, чужеродными для организма, и у пациента может развиться аллергия, в результате чего он не сможет применять этот препарат. Кроме того, аллергия блокирует системный иммунитет, вследствие чего человек более подвержен внешним инфекционным заболеваниям. При местном применении антисмысловых олигонуклеотидов мы не трогаем центральный иммунитет, не трогаем вообще интегрирующие системы, действуем локально. Если нам удастся добиться положительного эффекта от введения электрофорезом, то, соответственно, мы ещё и момент травматизации человека при получении лекарств тоже сможем убрать.
